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  • 染色質免疫共沉澱技術(ChIP)

    染色質免疫沉澱法 (ChIP) 是一種用來在體內鑒定及分析基因組內部蛋白質-DNA 相互作用的有力研究技術。染色質免疫共沉澱技術的原理是在保持組蛋白和DNA聯合的同時,通過運用對應於一個特定組蛋白標記的生物抗體,染色質被切成很小的片斷,並沉澱下來。 這項技術主要用來分析目標基因有沒有活性、或者分析一種已知蛋白(轉錄因數)的靶基因有哪些。

    檢測目標基因活性
    在保持組蛋白和DNA聯合的同時,染色質被切成很小的片斷,通過運用對應於一個特定組蛋白標記的生物抗體,將目標片段(組蛋白發生特異標記的片段)沉澱下來。IP是利用抗原蛋白質和抗體的特異性結合以及細菌蛋白質的“protein A”特異性地結合到免疫球蛋白的FC片段的現象活用開發出來的方法(免疫磁珠結合proteinA,proteinA結合抗體Fc段,抗體結合抗原即發生特異標記的組蛋白,這裡要注意組蛋白是和DNA結合的,這樣就把目標群組蛋白和DNA的符合物沉澱下來了)。在將組蛋白與DNA分離,用獲得的DNA去做westren blot ,從而檢測那些基因的組蛋白發生了修飾。

    檢測已知蛋白的靶基因
    在生理狀態下把細胞內的蛋白質和DNA交聯在一起,超聲波將其打碎為一定長度範圍內的染色質小片段,然後通過所要研究的目的蛋白質特異性抗體沉澱此複合體,特異性富集目的蛋白結合的DNA片段,通過對目的片段的純化與檢測,從而明確蛋白與哪些基因相互作用。

    目前多用精製的protein A預先結合固化在argarose的beads上,使之與含有抗原的溶液及抗體反應後,beads上的prorein A就能吸附抗原達到精製的目的。實驗最需要注意點就是抗體的性質。抗體不同和抗原結合能力也不同,免染能結合未必能用在IP反應。建議仔細檢查抗體的說明書。特別是多抗的特異性是問題。其次,要注意溶解抗原的緩衝液的性質。多數的抗原是細胞構成的蛋白,特別是骨架蛋白,緩衝液必須要使其溶解。為此,必須使用含有強介面活性劑的緩衝液,儘管它有可能影響一部分抗原抗體的結合。另一面,如用弱介面活性劑溶解細胞,就不能充分溶解細胞蛋白。即便溶解也產生與其它的蛋白結合的結果,抗原決定族被封閉,影響與抗體的結合,即使IP成功,也是很多蛋白與抗體共沉的悲慘結果。再次,為防止蛋白的分解,修飾,溶解抗原的緩衝液必須加蛋白每抑制劑,低溫下進行實驗。每次實驗之前,首先考慮抗體/緩衝液的比例。抗體過少就不能檢出抗原,過多則就不能沉降在beads上,殘存在上清。緩衝劑太少則不能溶解抗原,過多則抗原被稀釋。